北京能治白癜风病的地方 http://m.39.net/pf/a_4570776.html前言
今天学习一篇综述，内容有点多
介绍
溶酶体是普遍存在的细胞器，能够降解蛋白质、核酸、多糖以及其他生物物质。受体、通道蛋白等膜蛋白和胞外物质以内吞的方式进入细胞，并通过溶酶体降解，有利于质膜修复、免疫反应、骨吸收以及病原体的消除。胞内的受损蛋白和细胞器则能被自噬体包裹后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，进而降解并释放降解产物以供细胞重复利用。
图1溶酶体通过自噬和内吞作用参与细胞内外物质的降解和再循环
溶酶体胞吐作用对溶酶体内容物的分泌、质膜修复、免疫反应、骨吸收以及病原体消除至关重要。通过溶酶体调控细胞内物质水平对于维持细胞正常代谢活动和防御微生物感染具有重要意义。溶酶体系统和蛋白酶体系统是细胞内两个最重要的蛋白降解途径，两种途径既能通过某种机制彼此联系以实现补偿或协同作用，又能发挥了自身独立作用，以确保细胞内物质的特异性降解。溶酶体途径在调节细胞内外蛋白质稳态中具有重要作用。
图2PROTACs（A）和靶向溶酶体途径的蛋白降解（B）
许多疾病的发生是由特定蛋白的突变或积累引起的，特异性降解致病蛋白能够从根本上对疾病进行干预或治疗，具有重要的科学和临床价值。近年来，科学家开发了许多沉默蛋白技的术，例如，靶向蛋白水解嵌合体（PROTAC）、RNA干扰（RNAi）、CRISPR技术等。其中PROTAC是目前最有效的药物发现方法之一，其原理是PROTAC双功能分子通过一个连接链（linker）将目标蛋白的配体和E3泛素连接酶的招募配体连接，进而招募E3泛素连接酶对目标蛋白进行泛素化，之后蛋白酶体会识别泛素标记的底物蛋白并将其降解，以达到治疗疾病的目的。目前，PROTAC分子ARV-、ARV和CC-已进入临床试验，但是，PROTAC只能降解某些胞内蛋白。
溶酶体能有效除去某些与癌症、自身免疫性疾病、衰老相关疾病密切相关的大分子蛋白、蛋白聚集体、受损或多余的细胞器和胞外蛋白。因此，基于溶酶体的生物物质选择性降解策略具有巨大潜力，基于溶酶体的降解剂开发将是通过蛋白质降解实现疾病治疗的重要发展方向。此外，细胞自噬激动剂不能诱导溶酶体特异性降解异常蛋白，开发诱导溶酶体特异性降解疾病相关蛋白而不影响正常蛋白的分子是发现创新药物的新策略。
通过溶酶体途径降解蛋白质或细胞器
细胞内物质的平衡，细胞稳态的维持以及人体细胞的正常生理功能与溶酶体和蛋白酶体系统密不可分，两种途径既相互独立又有交联。一方面，泛素-蛋白酶体系统主要降解可溶性，短寿命和错误折叠的单体蛋白，而溶酶体系统主要降解长寿命蛋白，蛋白聚集体和受损的细胞器，两种途径均可通过泛素化实现底物降解；另一方面，两种途径可以协同降解细胞内同一底物。通过溶酶体途径的蛋白质降解极大地扩展了已知底物范围，为靶向传统的非靶标蛋白质提供了新的策略。
图3溶酶体的对生物物质降解途径
溶酶体膜上具有参与物质运输出入的相关蛋白，蛋白质向溶酶体的转运需要溶酶体靶向受体（lysosome-targetingreceptor，LTR）参与。溶酶体的形成是一个复杂的过程，不同类型的细胞甚至同一类型的细胞可能采用不同的途径。在内质网中合成的溶酶体水解酶主要通过两种方式进入溶酶体：1）大多数水解酶能够被甘露糖6磷酸受体（M6PR）修饰，然后被高尔基体识别，转运至溶酶体，是目前研究最成熟的方法。2）溶酶体整合膜蛋白2（lysosomalintegralmembraneprotein2，LIMP-2）参与葡萄糖脑苷脂酶向溶酶体的转运。组织中广泛表达的M6PR可以有效地将底物转运至溶酶体。因此，可以筛选与M6PR、LIMP-2及其他LTR具有高亲和力的分子，并将其与靶蛋白连接，以实现靶蛋白降解。
溶酶体通过胞吞作用和自噬两种方式选择性清除蛋白聚集体，病原体和多余或受损细胞器，导致不同来源的物质在细胞内降解。胞吞作用是吸收细胞营养物质，获取外部信息和更新质膜的重要方式。自噬是一种高度保守的细胞降解过程，分为三种类型：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬（Chaperone-mediatedautophagy，CMA）。巨自噬过程中，聚集的蛋白质被自噬受体识别，并选择性封闭于自噬体中，然后与溶酶体融合并降解。微自噬是一种吞噬过程，溶酶体膜直接吞噬细胞质内成分，并降解的过程。CMA是高度选择性的自噬过程，只能降解某些特定蛋白质，而不能降解细胞器。自噬在所有真核细胞中都存在，并且在癌症，神经退行性疾病和代谢性疾病等许多人类疾病中异常表达。因此，通过自噬降解某些靶蛋白可能对药物发现有潜在的应用。
溶酶体靶向嵌合体（LYTACs）的药物发现
阳离子非依赖性甘露糖6磷酸受体（CI-M6PR）是LTR家族的典型代表，可以介导蛋白质向溶酶体的转运及后续的降解过程。CI-M6PR通过其在高尔基体、内体（膜包裹的囊泡结构）和细胞表面的组成性循环诱导被甘露糖6-磷酸（mannose6-phosphate，M6P）修饰的N-聚糖蛋白的内吞和溶酶体降解过程，溶酶体内的低PH条件引起CI-M6PR解离，底物蛋白被降解，CI-M6PR通过高尔基体转运到细胞膜上循环利用。
通过化学手段将能够靶向CI-M6PR的N-羧基环酸酐（N-carboxyanhydride，NCA）衍生的糖多肽连接到能特异性结合靶蛋白的抗体上，形成能够靶向特定蛋白的LYTACs。基于CI-M6PR的LYTACs主要包括2个部分：能与CI-M6PR结合的含M6P支链的NCA聚糖肽和能与待降解蛋白特异性结合的抗体。
图4溶酶体靶向嵌合体（LYTACs）降解细胞外和膜蛋白
研究人员分别设计并优化了含有M6P支链的NCA聚糖肽和能与底物蛋白特异性结合的抗体。将抗小鼠IgG抗体（相当于二抗，可以配合各种一抗，降解对应的底物蛋白）共价偶联与多聚丝氨酸-O-甘露糖-6-膦酸酯（poly-serine-O-mannose-6-phosphonate，M6Pn）共价偶联，得到第一个LYTAC分子Ab-1。Ab-1与K细胞、荧光素标记的小鼠IgG共同孵育，发现溶酶体中的荧光信号与对照组相比增加了40倍；Ab-1也能够将荧光素mCherry蛋白和对应的抗mCherry抗体转运到细胞中，证明LYTAC可以通过溶酶体途径将抗体从其正常免疫功能部位重新定位，实现细胞外靶蛋白的降解；Ab-1也可以将ApoE4（一种参与神经退行性疾病的蛋白）转运到溶酶体中进一步降解，证明对分泌蛋白的适用性。当小鼠抗CD71抗体和Ab-1在细胞中孵育时，受体蛋白CD71被摄取并通过溶酶体降解。
将多聚M6Pn共价偶联到EGFR抗体西妥昔单抗上得到的第二个LYTAC分子Ab-2，在HeLa细胞、乳腺癌、肺癌等多种细胞系中，可以特异性降解EGFR，且没有脱靶效应。PD-L1是一种能够促进癌细胞逃避免疫系统的跨膜蛋白，以抗PD-L1抗体和M6Pn偶联得到了第三LYTAC分子Ab-3，在PD-L1阳性的MDA-MB-细胞中发现细胞表面PD-L1水平显着下降。
某些LTR的表达具有组织特异性。因此，设计靶向组织特异性LTR的分子可以诱导特定组织中靶蛋白的降解，实现精确治疗。去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）是一种肝脏组织特异性的LTR，将识别靶蛋白的抗体和靶向ASGPR的N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）的糖蛋白偶联组成的GalNAc-LYTAC可以实现肝脏特异性靶蛋白的降解。研究人员将肝癌细胞与其他不表达ASGPR的细胞共培养，证实了GalNAc-LYTAC的细胞特异性。
总之，基于ASGPR的LYTAC技术是可行、有效和特异性的。LYTAC技术可以直接靶向细胞外和膜相关蛋白，通过溶酶体途径进行降解。LYTAC是PROTAC的良好补充，细胞外和膜蛋白占编码蛋白的40％，是衰老相关疾病，自身免疫性疾病和癌症的关键因素。基于CI-M6PR的LYTAC已经取得初步成功，寻找和研究其他可循环利用的LTR是要的。另外，抗体具有特异性和低误靶率特点，该方法关键在于抗体与具有有效靶向性的可循环LTR结合时需要保持其特性。
自噬靶向嵌合体（AUTACs）的药物发现
内源性核苷酸8-硝基环单磷酸鸟苷（8-硝基-cGMP）是细胞募集自噬体的重要信号分子。于是，研究人员设计了基于内源性修饰cGMP（S-鸟苷酸化）的自噬靶向嵌合体（AUTAC）的小分子，用以募集自噬体，分子包括3部分：用于募集自噬体（鸟嘌呤衍生物）的标签、linker、靶向蛋白或细胞器的配体。通过这种方法设计的分子成功降解了细胞质蛋白和破碎的线粒体。通过优化，研究人员发现4-氟苄基鸟嘌呤是最合适自噬体募集配体。
图5自噬靶向嵌合体（LYTACs）降解细胞质蛋白和损伤线粒体
对氟苄基鸟嘌呤（FBnG）通过聚乙二醇linker与烟曲霉醇连接得到了化合物1。其中，降解标签是FBnG，可以特异性募集自噬体，烟曲霉醇部分能够结合蛋氨酸氨基肽酶2（MetAP-2），在HeLa细胞中，10μM的化合物1成功降解80％的MetAP-2。当加入溶酶体抑制剂bafilomycinA1时，MetAP-2的降解被抑制，表明降解机制是通过自噬完成的。
FK结合蛋白（FKBP12）参与细胞内Ca2+的释放，这与免疫抑制和神经细胞再生有关。将非共价靶向FKBP的SLF通过聚乙二醇与FBnG连接得到化合物2，在HeLa细胞中，10μM的化合物2成功降解FKBP12蛋白。
溴结构域蛋白4（BRD4）的表达上调与肺癌，乳腺癌，急性髓细胞性淋巴瘤，肝癌等的发生和发展密切相关，通过聚乙二醇将BRD4抑制剂JQ1和FBnG连接获得化合物3，但10μM化合物3处理的A细胞，BRD4的水平仅略微降低。
线粒体功能障碍与许多与衰老相关的疾病有关，除去损伤线粒体可能会改善相关疾病。2-苯基-3-乙酮酰胺是线粒体外膜上的转运蛋白，因此以2-苯基吲哚衍生物作为靶向线粒体配体，通过聚乙二醇将其与FBnG连接得到化合物4，实现线粒体的溶酶体降解，具有改变唐氏综合症中成纤维细胞的线粒体活性的潜力。这些结果证明了AUTACs的可行性，在未来发现自噬相关药物方面可能具有广泛的应用，但依然需要对AUTAC对蛋白聚集体的降解作用、AUTAC降解机制等作进一步研究。
连接自噬体化合物（ATTECs）的发现
LC3是一种自噬关键蛋白，自噬形成时，胞浆型LC3（LC3-I）转变为自噬体膜型LC3（LC3-II），是自噬体的结构蛋白之一，在自噬形成中发挥重要作用。
图6ATTEC分子结合LC3和自噬体降解病原性蛋白
为了寻找能够诱导自噬降解突变型亨廷顿蛋白（mHTT）的小分子，研究人员通过基于小分子微阵列（SMMs）和斜入射反射率差异（OI-RD）的高通量筛选得到化合物5和6，两者能够结合LC3蛋白和突变型亨廷顿蛋白，而结合野生型亨廷顿蛋白，进而选择性降解了mHTT，不影响野生型HTT蛋白。通过相似性搜索获得了另外两个ATTAC分子7和8，研究发现，在亨廷顿病（HD）患病小鼠中，化合物5和8能够通过血脑屏障进入大脑，直接减少大脑皮层和纹状体的mHTT蛋白水平。ATTECs有望为HD的临床治疗提供新的机会，也可以应用于其他多聚谷氨酰胺疾病（polyQ）疾病。
机制研究表明，ATTEC分子通过与LC3和靶蛋白相互作用，选择性实现靶蛋白的降解。该策略的关键是通过药物化学方法详细研究小分子与LC3作用界面，开发出能与两者的相互作用的分子。此外，基于已知结构的优化也是重要的开发方法、高通量筛选方式可以发现新型结构。然而，ATTEC能否破坏正常大脑蛋白、能否导致对神经系统的而成损坏也尚不清楚，需要进一步研究。
CMA介导的蛋白降解药物发现
在分子伴侣介导的自噬过程中，分子伴侣热休克蛋白70（HSC70），识别细胞质内具有KFERQ序列的可溶性蛋白底物并形成复合物，分子伴侣-底物复合物与溶酶体膜上的溶酶体相关膜蛋白2A（lysosome-associatedmembraneprotein2A，LAMP2）结合，通过位于溶酶体腔的HSC70，底物蛋白被转运到溶酶体中分解，然后被细胞再利用。
图7ATTEC分子结合LC3和自噬体降解病原性蛋白
研究人员发现，一条由46氨基酸组成、包含两个不同HSC70结合基序和两个聚谷氨酰胺结合肽1序列副本的肽链（QBP1），可以识别突变的亨廷顿蛋白中扩展的polyQ序列而不与正常人突变亨廷顿蛋白polyQ基序结合，在小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro2a中，该肽可以通过CMA特异性降解具有扩展的polyQ序列的mHTT。另外的研究人员设计了一个肽系统，包括三部分：可以跨血脑屏障和质膜传递的细胞膜穿透结构域（CMPD）、与目标蛋白特异性结合的结构域（PBD）、CMA靶向结构域（CTM）。该肽能通过CMPD进入细胞，然后通过PBD和CTM之间的相互作用特异性识别并与其靶蛋白形成稳定的复合物，并通过CMA途径进入溶酶体迅速降解。以相同的方式设计了能够降解骨架蛋白PSD-95、死亡相关蛋白激酶1（DAPK1）、α-突触核蛋白的三个肽分子。
通过设计特异性结合CDK5的伴侣介导的自噬靶向基序（Tat-CDK5-CTM）得到了能够降解细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK5）肽分子。靶向溶酶体降解的肽类设计提供了一种调节内源蛋白水平的新方法。HIP1R是PD-L1通过溶酶体降解的调控因子，可以直接与PD-L1相互作用，将PD-L1转运至溶酶体降解，HIP1R和PD-L1之间的相互作用取决于PD-L1的结构基序和靶向溶酶体的信号肽。基于此，研究人员设计了含有通过HIP1R与PD-L1结合获得的表位标签肽和CMA分类信号序列KFERQQKILDQRFFE，能够显著降低了PD-L1的水平。之后又设计了包含能够结合PD-L1结合的HIP1R和介导PD-L1向溶酶体运输的序列得到了PD-LYSO多肽，PD-LYSO可以将肿瘤细胞中的PD-L1带至溶酶体进行降解。
靶向CMA降解的肽设计为科学研究提供了强大的工具，并为开发和治疗蛋白质错误折叠引起的疾病提供了新的策略。然而，仍然有一些缺点：1)设计这类肽需要与靶蛋白具有高亲和力的结构域；2）作为治疗剂的肽的递送和稳定性依然有待解决。
总结
当前，诱导钯蛋白降解的PROTAC代表了一种崭新的技术，引起了广泛
