北京皮肤病专治医院 http://m.39.net/pf/a_4781506.html牛乳过敏是一种常见的食物过敏反应。在导致牛乳过敏反应的蛋白中，β-乳球蛋白（β-LG）被认为是主要的过敏原。采用共价修饰技术降低β-LG抗原性已成为国际乳制品加工技术研究的重点。但常用共价修饰手段如糖基化、磷酸化等随机修饰，存在修饰位点选择性低、稳定性不理想、修饰产物不均一等问题。研究表明β-LG抗原性同时受线性表位和构象表位影响，共价修饰发生在不同位点会对蛋白构象及抗原性产生不同影响。为明晰不同位点共价修饰对β-LG抗原性的影响，实现共价修饰对β-LG抗原性的有效调控，需采用定点修饰技术以制备均一化修饰产物。
在PEG蛋白修饰常用基团中，巯基因其含量少成为PEG定点修饰中的理想位点，目前针对β-LG巯基使用PEG定点修饰的鲜见报道。并且β-LG第位半胱氨酸（Cys）游离巯基位于被97%人血清识别的主要抗原表位肽段AA-中，游离巯基或是探究不同结合位点对β-LG抗原性影响及实现β-LG致抗原性调控的关键位点。
因此南昌大学食品科学与技术国家重点实验室的刘成梅、江辛琳和罗舜菁*等人针对β-LGCys游离巯基，选择5kDa单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺（mPEG-MAL）对其进行定点修饰（图1），以期获得高修饰率β-LGPEG定点修饰产物，并对修饰前后β-LG抗原性进行探究。
1单因素试验结果
1.1β-LG与mPEG-MAL反应物质的量比对修饰反应的影响如图2a所示，条带1～6对应修饰率分别为3.2%、11.3%、18.6%、26.3%、41.2%、41.9%（图2b）。产物修饰率随mPEG-MAL添加比例的增加而升高，反应物质的量比达1∶30后，增加PEG的量修饰率变化不明显。因此选择1∶30作为最佳蛋白与PEG物质的量比。1.2反应时间对修饰反应结果的影响如图3a所示，条带1～6对应修饰率分别为4.1%、18.3%、23.6%、31.4%、42.1%、42.8%（图3b）。当反应时间超过24h后，β-LG与mPEG-MAL反应完全，PEG修饰产物的量达到最大。因此选择24h作为最佳反应时间。1.3pH值对修饰反应的影响如图4a所示，条带1～6对应修饰率分别为33.8%、32.1%、34.9%、36.7%、34.2%、35.5%（图4b）。实验中不同pH值下的修饰率无显著变化，说明此反应条件可能较好地保持β-LG在不同pH值溶液中的稳定性。也可能因PEG链包裹在蛋白外部能形成一层独特的水化层，其对蛋白产生空间屏蔽的保护作用，使得pH值变化对反应产物修饰率影响不显著，因此选择生理条件pH7为最佳反应pH值。1.4TCEP添加量对反应结果的影响将不同TCEP反应产物进行SDS-PAGE及凝胶过滤色谱分析，图5a中条带1～5对应修饰率分别为5.9%、17.9%、32.5%、42.1%、43.2%（图5b）。随着TCEP添加量的增加，反应产物修饰率得到显著提升，当TCEP添加量至蛋白3倍后，修饰率无显著变化，因此选择3倍物质的量为本实验最佳TCEP添加量。1.5乙醇体积分数对反应的影响如图6a所示，条带1～6分别对应修饰率为35.6%、37.1%、37.8%、40.1%、39.8%、49.2%（图6b），乙醇体积分数为25%时修饰率达到最高为49.2%。在本实验中，当乙醇体积分数达30%时，蛋白出现大量不溶沉淀，说明高浓度乙醇环境蛋白溶解性下降，不适合进行修饰反应，因而未对更高浓度进行条件优化实验。综上，通过单因素试验，研究不同反应条件对该修饰反应的影响，确定本实验最佳修饰条件：β-LG与mPEG-MAL物质的量比1∶30，在0.1mol/L、pH7.0的PBS（含3倍物质的量的TCEP，25%乙醇溶液及2mmol/LEDTA）中4℃反应24h。
2修饰产物的分离纯化及修饰率鉴定
β-LG等电点在5.1～5.3左右，修饰所用PEG化合物为电中性不带电，经修饰后，PEG会屏蔽蛋白表面电荷使蛋白表面所带电荷有所区别，因此本实验可采用阳离子交换层析分离纯化β-LG-MAL修饰产物。实验中，β-LG在pH4.5的缓冲液中带正电，吸附于带负电的层析介质中；而β-LG-MAL修饰产物经PEG修饰后与层析介质的结合强度会有所减弱，因此β-LG-MAL修饰产物会先于未修饰的蛋白而被洗脱下来。根据单因素试验优化得出最佳修饰条件，制备β-LGPEG定点修饰产物，并对优化产物进行分离纯化。将修饰混合液经阳离子层析交换柱SPSepharoseFastFlow进行分离纯化，如图7所示，得到2个洗脱峰，并通过SDSPAGE对洗脱峰进行鉴定验证，分析显示保留时间较短的峰1为β-LG-MAL的单修饰产物（图7b，条带2），分子质量约为28kDa；峰2为未反应完全的β-LG（图7b，条带1），分子质量约为18kDa；β-LG-MAL的单修饰产物表观分子质量高于单点修饰产物的理论分子质量，是因为当PEG溶于溶液中时，分子中的乙氧基单元易于水分子结合，使其水化半径增大，表观分子质量约为PEG实际分子质量的2～3倍，因此本实验中制得产物为β-LGMAL的单修饰产物。图6a显示阳离子交换层析分离效果较好，优化产物修饰率达64.1%，远高于β-LG随机修饰的修饰率38%。
3修饰产物纯度的鉴定
大量收集图7a中峰1，使用截留分子质量为10kDa的超滤离心管于冷冻离心机中以r/min离心15min，浓缩得到β-LG-MAL的单修饰产物样品（图7b，条带3）。取样通过凝胶过滤色谱测定修饰产物纯度，如图8所示，当洗脱液体积为9.5mL时所出峰为单修饰产物β-LG-MAL，通过柱层析系统软件峰面积计算样品纯度达94%。
4修饰位点鉴定
本实验通过对游离巯基含量进行测定以确定PEG衍生物与β-LG游离巯基的结合情况。实验中所用mPEG-MAL是一种巯基特异性PEG衍生物。mPEG-MAL与Cys游离巯基的特异性结合结果验证可以体现在两方面：首先，对修饰产物进行电泳鉴定发现所得产物为仅有一单一条带的单修饰产物。若PEG结合在非Cys的任何巯基，说明蛋白内部二硫键打开，存在多个游离巯基，则1.1节中在mPEG-MAL加入过量情况下，修饰产物的SDS-PAGE不应为单一条带，而是出现多修饰条带，电泳鉴定发现所得产物仅有一单一条带说明本实验中蛋白内部二硫键保持完好。再者，在蛋白内部二硫键保持完好的情况下，β-LG游离巯基含量即β-LG唯一游离巯基Cys游离巯基的含量。对分离纯化后产物进行游离巯基含量测定显示，经PEG修饰后β-LG游离巯基含量由52.3μmol/g降为0.3μmol/g（P＜0.05），说明修饰产物中Cys游离巯基含量几乎降为零，游离巯基已与mPEG-MAL发生共价结合，因此未被检测到。综上，可验证Cys游离巯基已与mPEG-MAL发生特异性结合。
5修饰前后β-LG抗原性分析
研究显示PEG修饰能有效降低蛋白免疫原性，然而本实验经mPEG-MAL对β-LGCys游离巯基定点修饰后，β-LG-MAL抗原性显著提高约25.9%，如图9所示。本团队前期采用PEG定点修饰β-LG谷氨酰胺残基得到产物β-LG-NH2，β-LG-NH2抗原性显著下降59.04%；对β-LG的N-末端氨基进行修饰得到β-LG-ALD，β-LG-ALD抗原性显著下降53.8%，该2种位点修饰使蛋白抗原性下降原因都归结于PEG链对于蛋白的空间屏蔽作用，掩盖了β-LG表面部分抗原决定簇。本实验中，PEG的巯基定点修饰却没有因PEG链的屏蔽使抗原性下降，说明结合位点对β-LG抗原性的影响较PEG链的屏蔽作用更为显著。β-LG中肽段AA41-46、AA-和AA-为主要抗原表位，分别为92%、97%、89%的人血清识别。实验中Cys游离巯基位于被97%人血清识别的主要抗原表位肽段AA-中，并且由于β-LG致敏性同时受线性表位和构象表位影响，因此可能是修饰后原处于蛋白内部的致敏位点暴露，或者有新的构象致敏表位形成导致β-LG致抗原性显著提升。
结论与讨论
本研究采用PEG定点修饰技术，使用5kDamPEGMAL对β-LG第位游离巯基进行修饰。通过单因素试验不同条件对修饰反应结果的影响，得到最佳修饰条件：β-LG与mPEG-MAL物质的量比1∶30，在0.1mol/L、pH7.0的PBS（含3倍物质的量的TCEP，25%乙醇及2mmol/LEDTA）中4℃反应24h，在此条件下蛋白修饰率达64.1%，对比β-LG的PEG随机修饰定点修饰率有大幅提高，约为传统修饰的1.7倍。阳离子交换层析显示，实验中所选择洗脱条件及溶液对β-LG-MAL单修饰产物分离纯化效果较好，收集纯化产物对样品纯度进行鉴定，所得样品纯度达94%。通过电泳联合巯基含量检测对修饰位点进行鉴定确定β-LG第位游离巯基与mPEG-MAL发生特异性结合。β-LG-MAL抗原性测定结果前期实验截然不同，与前期不同位点修饰进行比较，发现共价位点对蛋白抗原性的影响显著高于PEG链对抗原决定簇的屏蔽作用。经巯基修饰后β-LG抗原性提升25.9%，抗原性的提升可能由于修饰后原处于蛋白内部的致敏位点暴露，或者是新蛋白构象致敏表位的形成。本实验说明与普通共价修饰相比，PEG定点修饰能有效探究不同位点对β-LG抗原性的影响，而对于巯基修饰致使β-LG抗原性提升的机理验证，还需下一步对修饰前后β-LG构象变化等进行探究以确定β-LG构象、结合位点与抗原性之间的关系。
本文《β-乳球蛋白聚乙二醇定点修饰物的制备及其抗原性变化》来源于《食品科学》年42卷2期1-7页，作者：刘成梅，江辛琳，李冬梅，周磊，钟俊桢，吉莉，罗舜菁。DOI:10./spkx---。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
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