撰文
裴晓如
Abstract
儿童脑瘤是儿童癌症相关死亡的主要原因。尽管基因组技术已开始阐明许多儿童脑肿瘤的发病机制，但仍有一些挑战限制了这些发现转化为新的有效疗法。此外，虽然RNA分析已经确定了组织学诊断中的亚群，并强调了这些亚群中被认为是活跃的通路，但针对这些通路在很大程度上是不成功的。
近年来，定量质谱分析法和生物信息学分析已经成熟。研究表明，RNA转录丰度与蛋白质丰度之间存在明显的解偶联关系，尤其是在癌症中。这一事实可以解释基于基因组的生物学发现和临床验证之间的重大脱节。这些整合的蛋白质基因组学数据集的分析有可能帮助鉴定新的治疗途径。此外，因为不同的上游基因组事件可能导致类似的下游通路变化，通过仔细研究这些结果事件，蛋白质组学可以识别跨组织和分子边界的共同生物学。
为了将蛋白质组学纳入对小儿脑肿瘤的生物学理解中，作者进行了首次大规模综合蛋白质组学分析，其中包括代表7种不同组织学诊断的个肿瘤样本的大样本组的基因组学、转录组学以及全局和磷酸化蛋白质组学。基于蛋白质组的无监督聚类揭示了先前被认为生物学上不同的肿瘤诊断子集之间令人惊讶的相似性，并产生了本文所述的许多见解。作者力求证明，将蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学维度纳入大规模的多组学研究中，可以产生有助于推动翻译工作的功能见解。
Results
儿童脑肿瘤标本的蛋白质基因组学分析
作者对来自代表7种组织学类型的例患者的份新鲜冷冻肿瘤样本进行了全基因组测序（WGS）、RNA测序（RNA-seq）、定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。图1A显示了7种组织学类型的样本分布：低等级神经胶质瘤（LGG;n=93）、室管膜瘤（EP;n=32）、高等级神经胶质瘤（HGG;n=25）、髓母细胞瘤（MB;n=22）、神经节胶质瘤（n=18）、颅咽管瘤（CP;n=16）和非典型性类畸形横纹肌瘤（ATRT;n=12）。
所有个组织样本均采用液相色谱和三重质谱串联质量标签（TMT）等压标记分析。共鉴定和定量了8,个蛋白质和18,个磷酸化位点。其中，在至少一次组织学诊断中，超过50%的样本中观察到6,个蛋白质和4,个磷酸化位点，并考虑进行下游分析。此外，作者排除了缺血诱导蛋白中的个磷酸化位点，以避免因样本收集的变化而引起的任何人为影响。
大多数样本也进行了WGS和RNA-seq。经过质控后，分别获得个、个和个肿瘤样本的体细胞突变、DNA拷贝数改变和基于RNA-seq的基因表达数据。
Fig.1儿童脑肿瘤的蛋白质基因组聚类
儿童脑肿瘤的蛋白质基因组聚类
基于全局蛋白质组学数据的共识聚类确定了八个聚类（图S1A），它们具有不同的生存结果（图1C）、干性评分、增殖指数和通路活性（图1D；表S1）。作者将这八个聚类称为：室管膜型、髓母细胞型、侵袭型、颅咽管/LGG-BRAFVE型、HGG富集型、神经节富集型、LGGBRAFWT富集型和LGGBRAFFusion富集型。
虽然一些聚类与组织学诊断相一致，如髓母细胞，但其他聚类包含不同诊断的混合（图S1B）。首先，颅咽管/LGG-BRAFVE型（C4）将颅咽管瘤（CP）的一个子集与带有BRAFVE突变的LGG肿瘤合并，而剩余的CP肿瘤合并至LGGBRAFWT富集型（C8）中（图1D和S1A）。基于磷酸化蛋白组数据的共识聚类分析也支持CP样本分离成两个不同的聚类（图S1A）。
虽然CTNNB1突变是儿童颅咽管瘤（CP）的重要致癌因素，但蛋白质组的C4和C8亚型并不能区分CTNNB1突变状态（图1E）。相反，它们更接近于LGG中BRAFVE诱导的模式（图1D和5A）。作者的研究结果表明，尽管一组儿童CP肿瘤缺乏BRAFVE突变，但它们表现出了与BRAFVELGG肿瘤相似的蛋白质组学变化。这引发了一种假设，即一些儿童CPs可能受益于基于MEK抑制剂（MEKi）的治疗。事实上，一组被MEKis下调的基因在C4亚型的CP样本中被上调（图S1C）。此外，MEK/ERK激酶下游蛋白/底物，包括ERK1/2，在这些样本中上调（图1E、1F和S1C），这是BRAFVE突变的已知结果。
此外，与C8亚型的CP样本相比，AKT/mTOR通路的中心成员在C4亚型中表现出更高的激酶活性（图1E、1F和S1C），这与BRAFVE和BRAFWTLGG肿瘤的对比一致（图5B）。在BRAF驱动的肿瘤中，AKT通路被认为是RAF/ERK抑制后出现的耐药性通路。临床前研究已经证明了协同抑制AKT的主要效应因子MEK和mTOR在LGG中的价值。
为了验证感兴趣的蛋白质和磷酸化位点的TMT测量方法，根据免疫多反应监测（MRM）实验方案，将定制的蛋白质/磷酸化蛋白质标记面板的靶向质谱实验应用于同一组肿瘤样本。MEK/ERK通路中关键分子的MRM测量证实了C4和C8亚型中CP的显著差异（图1G）。此外，这些MRM检测可以准确地对CP的两种亚型进行分类（图1G），提示临床应用基于MRM的检测对这两种亚型进行分类是可行的。
另一个包含多种诊断结果的蛋白质组亚型是侵袭型亚型，其特征是生存结果差（图1C）。与室管膜亚型集群中的室管膜瘤（EPs）相比，无论其组织学如何，侵袭型亚型中的EPs与此亚型中的其他肿瘤更相似。具体来说，进化保守的多功能聚合酶相关因子1复合体（PAF1C）成员，包括PAF1、CDC73、CTR9、LEO1和RTF1，与室管膜亚型相比，在侵袭型亚型中显著上调（图S1D和S1E）。基于全局和磷酸化蛋白质组学数据，与室管膜亚型相比，这些因子在侵袭型亚型中也显示了上调模式。在RNA数据中，没有观察到EPs分离成不同的簇，也没有观察到PAF1C成员和下游参与者的一致上调。
小儿脑肿瘤的免疫浸润
作者基于RNA数据使用xCell进行细胞类型反褶积分析，推断不同细胞类型在肿瘤微环境中的相对丰度（图2A）。基于推断的细胞比例的共识聚类识别出五组具有独特免疫和基质特征的肿瘤：冷-髓质、冷-混合、神经元、上皮细胞和热肿瘤（图2A）。与蛋白质组簇相比，作者发现在更具侵袭性的蛋白质组簇中，如侵袭型、髓母细胞型和室管膜型，免疫浸润较低；而在LGGBRAFWT富集型、LGGBRAFFusion富集型和颅咽管/LGG-BRAFVE型中，免疫浸润较高（图2D和S2A）。
热肿瘤包含LGG、HGG和神经节胶质瘤的混合样本，其特征是存在多种类型的免疫细胞，包括巨噬细胞、小胶质细胞和树突状细胞（图2A）。与其他肿瘤相比，热肿瘤显示了免疫相关通路的上调（图2A和2B）。此外，根据热肿瘤中的RNA和蛋白质数据，发现腺苷生产者（例如，磷酸酶ENTPD1和NT5E）的表达上调，它们可以抵抗炎症性氧化应激，抑制免疫激活剂和激活免疫抑制细胞（图2A和2B），提示可以针对这些肿瘤研究减少腺苷的疗法。
神经元肿瘤包含LGG、HGG和神经节胶质瘤肿瘤的混合，但其独特之处在于谷氨酸受体信号转导、神经元通讯、细胞生长活化所涉及的神经递质转运途径的上调（图2A和2B）。谷氨酸受体可以激活Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMK2A/B/GD），该蛋白激酶与磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K;PIK3CA）结合，并通过半人马蛋白-a1（ADAP1）向RAS发出信号。一致地，GRIA1、CAMK2A/B/G/D、PIK3CA和ADAP1在神经元亚型中显著上调（表S2），进一步表明谷氨酸信号在神经元亚型中发挥了积极作用。与此同时，仅根据蛋白质组学数据，神经元亚型的特征是能量代谢通路上调，如氧化磷酸化（OXPHOS）、线粒体蛋白复合物和糖酵解（图2A-2C）。已知谷氨酰胺拮抗可以作为肿瘤免疫治疗的“代谢检查点”，这可能有利于像神经元亚型的肿瘤。
LGG肿瘤分裂为神经元亚型和热肿瘤亚型，肿瘤微环境异质性明显（图2A）。有趣的是，BRAFVE和BRAFFusion事件是LGG肿瘤的重要致癌驱动因素，与多种免疫特征密切相关。与野生型相比，BRAFFusion和BRAFVE肿瘤中的APMI类基因被上调（图2E和2F）。图2G进一步说明BRAF状态下小胶质细胞和巨噬细胞极化的显著差异；BRAFFusion促进更多的M2小胶质细胞，而BRAFVE促进更多的M2巨噬细胞。
上皮细胞亚型仅包含起源于牙源性上皮的CP肿瘤，其特征是EMT、免疫相关通路以及CTLA4和PD-1分子的上调（图2A和2B）。因此，CP可能受益于免疫检查点疗法。
最后，冷-髓质、冷-混合肿瘤亚型显示出WNT、β-cateninTCF复合体装配、细胞凋亡和蛋白酶体对信号传导的上调。这与最近的报道一致，即WNT信号活跃的肿瘤的特点是免疫浸润水平较低。此外，这些亚型基于蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据，而不是RNA数据（图2A-2C）。
Fig.2小儿脑肿瘤的免疫浸润
整合蛋白基因组学分析揭示突变和拷贝数变异（CNV）的功能后果
虽然与成人肿瘤相比，儿童肿瘤通常有较少的基因改变，但在该队列中观察到一些重复的DNA变异（图S3A）。作者首先评估了少数体细胞突变对RNA/蛋白水平的影响。与BRAFWTLGG肿瘤相比，BRAFVE突变的LGG肿瘤显著下调了BRAF蛋白丰度（图3A），而在转录水平上下调不显著（图S3B）。CTNNB1突变导致CP样本中的蛋白/RNA水平升高，而NF1突变导致HGG中同源蛋白和转录本的下调（图3A和S3B）。与其他诊断结果相比，在ATRT样本中，SMARCB1RNA/蛋白显著下调，这是不同类型DNA改变的结果，包括突变、缺失和拷贝中性杂合性缺失（LOH）（图S3C）。
在基因组不稳定性方面，MB、HGG和EP肿瘤表现出相对较高的基因组不稳定性（图S3A）。通过整合拷贝数、RNA和蛋白质组学数据，作者检测到个基因，它们的转录和蛋白丰度在一个或多个诊断中同时受到自身CNV的影响，称为CNV-RNA/蛋白顺式级联事件（图S3D）。这些顺式级联事件列表有助于识别频繁扩增/缺失的基因组区域中的重要分子。一个例子是RABGAP1L（1q25），一种EPCNV-RNA/蛋白质/磷酸顺式级联基因（图3B和3C），其扩增与GTPase活化和RAB-GTPase结合有关，据报道该蛋白是EP的肿瘤进展中的独立预测因子。RABGTPase基因家族的另一个成员RAB3GAP2（1q41）在神经发育中具有关键作用，被确定为EP，MB和HGG肿瘤的CNV-RNA/蛋白质顺式级联基因。作者的分析进一步指出，FDPS作为HGG的一个CNV-RNA/蛋白顺式级联基因，与RABGAP1L相近，在胶质母细胞瘤干细胞的维持中发挥着重要作用。
尽管在所有EP，MB和HGG肿瘤中均观察到RABGAP1L、RAB3GAP2和FDPS的复发性扩增，但仅在EP中观察到RABGAP1L扩增对其蛋白/磷酸化蛋白的显著影响，而FDPS仅在HGG中被发现是CNV/RNA/蛋白质级联事件（图3B和3C）。另一方面，对于MB，只有RAB3GAP2被鉴定为CNV-RNA/蛋白顺式级联基因。这些观察表明，在不同的诊断中，相同基因组区域的拷贝数变异可能导致不同的功能紊乱。
然后，作者研究了体细胞突变和CNVs在每次诊断中对蛋白质和磷酸化蛋白的反式调控效应。除了LGG中的BRAF突变/融合外，在编码β-连环蛋白的CTNNB1突变与CP中的许多蛋白质和磷酸位点之间还检测到了唯一深刻的反式调节作用（图3D；表S3）。正如预期的那样，CTNNB1突变提高了β-连环蛋白丰度，被发现与细胞间粘附相关的蛋白/磷酸化蛋白以及WNT信号通路成员，如APC、GSK3A和GSK3B的上调相关（图3D和3E）。众所周知，WNT信号可导致β-连环蛋白的释放和转位到细胞核，后与转录因子（TCF）复合物结合激活转录（图3F）。在此数据中，作者观察到CP中TCF4、TCF25和CTNNB1突变的蛋白/磷酸化位点丰度与RNA显著相关。β-连环蛋白与TCF4的相互作用已被提出作为开发其他肿瘤类型抗癌药物的靶点。作者观察到，在CTNNB1突变组中，TCF4的RNA表达和磷酸化位点丰度显著降低；TCF25的RNA和蛋白质组丰度在CTNNB1突变的CP中上调。这些结果表明，在这组CP中，CTNNB1突变的下游效应可能是由TCF25介导的。
Fig.3基因组改变对转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组丰度的影响
激酶活性的磷酸化蛋白质组学分析
CDK1和CDK2是促进G2M过渡并调节G1进程和G1-S过渡的重要细胞周期蛋白依赖性激酶，基于全局丰度和激酶活性在包括ATRT，MB，HGG和EP在内的更多增殖型肿瘤中升高（图4A和S4B）。CDK1和CDK2在增殖型肿瘤中的激活也被其整体丰度和激酶活性评分之间更高的相关性所证实（图4A）。随后，作者构建了特异性激酶-底物网络，发现CDK2与MCM2、NPM1和TERF2IP等多种增殖相关因子存在特异性关联，意味着CDK2在影响细胞增殖中的机制多样性。
另一个重要的激酶是CaMK2A，它直接参与胶质瘤细胞的转移侵袭。虽然CaMK2A在神经节胶质瘤中最为丰富，但其激酶活性评分与蛋白丰度在HGG中存在较高的相关性（图4A）。HGG的激酶-底物网络进一步强调了CaMK2A和GJA1在Ser和Ser之间的关联（图4B和S4A）。此外，在HGG中，CaMK2A蛋白丰度被发现与SYN1Ser和SYN1Ser相关（图4B和S4A）；后者增加突触传递并调节突触囊泡动力学。这进一步证实了CaMK2A在胶质瘤侵袭中的相关作用。有趣的是，CDK1/2和CaMK2A的激活表现为蛋白丰度的升高，且倾向于相互排斥，表明HGG肿瘤存在两种不同的信号机制（图4C）。随后，通过在独立队列中进行验证，证实了CDK1/2和CAMK2A蛋白丰度之间的负相关关系（图4C），表明HGG肿瘤之间的确存在两种不同的信号机制。
另一组有趣的激酶，CDK5和GSK3B，在神经节胶质瘤和属于神经节丰富亚型的LGG亚群中上调（图4A）。CDK5和GSK3B被认为是突触形成、神经发生和细胞增殖的调节因子。通过激酶-底物网络分析，发现胶质瘤可以通过创建神经元-胶质瘤突触来劫持神经元的发育，并与免疫聚类联系起来。
Fig.4激酶活性的磷酸化蛋白质组学分析
LGG蛋白基因组学分析的启示
为了帮助识别来自LGG中频繁的BRAF靶向改变的生物学见解，作者鉴定了与BRAFve突变和BRAFFusion相关的蛋白（表S5）。与BRAFWT肿瘤相比，BRAFve和BRAFFusion病例均表现出常见的改变型特异性改变（图5A）。特别是在BRAFVE中，作者观察到丝裂原活化蛋白激酶（MAPK；ERK）信号通路（图5A）。MAPKs是RAS/RAF/MAPK通路的末端，其抑制剂已被用于治疗BRAF改变的多种癌症类型的肿瘤，包括脑肿瘤。对此数据中基于RNA表达的“MEKi标志物”的研究证实，与BRAFWT肿瘤相比，BRAFVE中MEK激酶下游的基因大大上调（图S5B），这支持了目前对这些LGG肿瘤使用MEKi治疗。此外，AKT丝氨酸/苏氨酸激酶AKT1和AKT2的RNA/蛋白质丰度以及AKT1S1的RNA（图5B；表S5）在BRAFVE肿瘤中显示出明显的上调。在同一组肿瘤上测量AKT亚型的MRM实验进一步验证了这种上调（图5B），揭示了协同抑制AKT的主要效应因子MEK和mTOR在LGG中的价值。
接下来，作者采用基于网络的方法来研究BRAF改变对磷酸化蛋白质组的影响。两个模块（图5C和S5C）分别在BRAFve和BRAFFusion样本中显著上调。模块1显着富集了与MYC靶点相关的磷酸位点（图5C）和G2M检查点，从而证实了BRAFVE与BRAFWTLGG相比个体的细胞周期相关途径上调（图5A）。此外，模块1显着富集了由AKT2调节的磷酸位点（图5D）。这些观察结果进一步支持了在BRAFVELGG中抑制mTOR/AKT的概念。
另一方面，模块2捕获了一组在BRAFFusion中受干扰的磷酸位点，但在BRAFVE情况下未捕获（图S5C–S5E）。在此模块中，与这些磷酸位点相关的最强药物作用激酶是PDGFRA，它编码细胞表面的酪氨酸激酶受体（图S5D）。此数据显示，BRAFFusion样本中PDGFRA蛋白/RNA的上调与HGG肿瘤中的惊人相似（图S5A），这表明在BRAFFusion肿瘤中也探索了PDGFRA靶向治疗。
Fig.5LGG蛋白基因组学分析的启示
HGG蛋白基因组学分析启示
作者首先调查了HGG患者中IDH蛋白丰度与总生存期（OS）之间的关联。由于已报道组蛋白H3.3（H3F3A，H3K27M）的点突变导致HGG的预后较差，因此在评估OS和IDH蛋白丰度之间的关联时应调整H3的状态。令人惊讶的是，在H3WT组中，所有IDH蛋白均与OS改善呈正相关（图S6A和6A；表S6）。基于RNA数据的平行分析检测到IDH1/2/3A与OS的表达之间存在相似的关联（图S6B）。一致地，具有IDH1/2/3的氧化磷酸化途径是其上调与H3WT个体中OS改善显著相关的主要途径之一（图S6C）。
虽然所有IDH蛋白均与OS呈正相关，但IDH1与IDH2/3蛋白丰度无相关性（图6B）。随后，作者通过在一个多变量Cox回归模型中共同对IDH1和IDH2蛋白进行建模，估计当IDH1和IDH2的总丰度降低50％时，在H3WTHGG患者中，死亡风险增加23.58倍（图6C）。为了进一步证实这一发现，作者对另外41个小儿HGG样本进行了TMT蛋白质组学分析实验。通过第二个数据集，在考虑了其他混杂因素，如数量或位置（图6D,6F和S6E）后，作者确认了联合IDH1/2蛋白丰度表达降低与OS缩短之间的关联。与H3WTHGG肿瘤不同，IDH1/2蛋白对H3MUT肿瘤的OS有不良影响（图6C和6D）。
随后，作者进行药物关联性分析，确定HGG的潜在药物靶点。根据RNA和磷酸蛋白质组学数据，预计CDK抑制剂可逆转HGG的侵袭性（图6G，S6F和S6G）。与LGG相比，HGG中CDK1和CDK2的激酶活性上调（图6H）。仅基于RNA数据，发现MEK、蛋白酶体和HDAC抑制剂具有重要意义（图6G，S6F和S6G）。尽管在HGG样品的蛋白质组学数据中未观察到MEK底物，但发现MEK下游的MAPK1激酶活性在HGG肿瘤中上调（图6H）。HGG肿瘤中CDK和MAPK1蛋白底物的上调支持CDK抑制剂和MEKis可能对HGG肿瘤有效。
Fig.6HGG蛋白基因组学分析的启示
初发和复发肿瘤的比较
基于此队列中来自同一个体的两种不同的疾病发生的18对手术样本的蛋白质组学和基因组学图谱，作者试图解决在治疗评估中当前的肿瘤是否应该被认为是独立的肿瘤的问题。
在所有的18对患者中，复发/进展性（RP）疾病与初始（IN）肿瘤具有相同的组织学诊断。RP肿瘤携带0%-52%的肿瘤突变（图7A），低于成人GBM和LGG。值得注意的是，所有三个MB进展样本都有TP53突变，而这在配对的原发肿瘤中是不存在的（图7A）。此外，RP样本中染色体臂畸变的数量也有所增加，平均断点数量从32个增加到53个（图7A）。大多数原发和复发样本被分为不同的蛋白质组学亚型（图7A），并且伴随着不同的通路激活（图7C）。通路激活的这些变化突显了需要对复发病例进行从头表征，这可能会影响治疗决策。
作者还研究了IN和RP蛋白组图谱对之间的相关性（图7B和S7B）。大量的原发性复发对在蛋白质组学水平上相互之间并不是高度相关的，这一事实支持了肿瘤复发（或进展）可能具有不同的肿瘤发生机制的观点。基于这些观察，一种评估复发事件独立于肿瘤内的分子特性的方法似乎是有保证的。
Fig.7初发和复发肿瘤的比较
Discussion
这项研究首次尝试对多种不同的儿童脑肿瘤诊断进行大规模的蛋白质基因组学整合分析，以发现新的有效的靶向治疗方法，代表了在多个层次的生物控制和跨越传统组织学边界的儿童脑肿瘤的生物学探究的重大进展。虽然一些组织学的样本数量有限，对某些研究造成了很大的限制，但作为此类组织学的第一个蛋白质基因组特征，该项目的数据和分析结果是有价值的资源。重要的是，医院、患者和家庭、慈善机构和联邦基金以及物理学家、科学家和计算生物学家之间必然广泛合作的结果。这些努力展示了大规模蛋白质基因组学的潜力，以及包容性合作的力量，以解决对我们的孩子普遍存在的威胁：儿童脑肿瘤。
编辑李良元原文引用